الأربعاء، 13 فبراير 2013

طرق تحضير العينات


الصبغــات وطرق الصبغ

                           Stains  and  Staining 

الغرض من الصبغ Purpose for staning:

إن الغرض من الصبغ هو جعل أجزاء الخلايا أو الأنسجة أكثر وضوحا ، وللصبغ نظريات عدة كانت محل جدل بين العلماء ، حيث كان التساؤل : هل هي ظاهرة فيزيائية بحته أم ظاهرة كيميائية بحته أو هي ظاهرة تعتمد على الظواهر الكيميائية الفيزيائية ؟.

عموما فإن طرق أو طبيعة الصبغ تتأثر بواحد أو بمجموعة من العوامل منها التالي :

1 ـ قوة الصبغة .

2 ـ سرعة تأين كل من الأنسجة البروتينية والصبغات .

3 ـ الأس الهيدروجيني ( pH ) لمحلول صبغة وكذلك للأنسجة البروتينية .

4 ـ نوع المثبت المستخدم .

5 ـ نوع محلول الصبغة كحوليا أم مائيا .

6 ـ تركيز الصبغة في محلول ضعيفا كان أم قويا .

تصنيف الصبغــات Classification of stains  :

الصبغات مواد عضوية ملونة تكون في الغالب أملاحا ، وتمتلك من الخواص بحيث تستطيع الأنسجة مسكها بثبات ولا يمكن إزالتها منها حتى عند إستخدام مذيبات نفس المادة العضوية . من المعلوم أن جميع الصبغات يجب أن تكون محتوية على مجموعتين أساسيتين هما :

1 ـ مجموعة ذرية مرتبطة باللون تدعى حاملات اللون   Chromophores .

2 ـ مجموعة لها القابلية على ربط المركبات الكيميائية للصباغات مع الأنسجة وتدعى ماسكات اللونAuxochromes  وتقسم الصبغات بطرق مختلفة تبعا للأسس المعتمدة في التقسيم .ونأتي إلى ذكر بعض النماذج من تقسيم  الصبغات وهي كالتالي :

تقسم الصفات تبعا لتركيز الأس الهيدروجيني للصبغة وعلى هذا الأساس من التقسيم يمكن تميز ثلاثة أنواع منها وهي :

أ ) الصبغات القاعدية  Basic stains :

هذه الصبغات إما أن  تذوب في الماء أو في الكحولات أو بكليهما ومن أمثلتها صبغة السفرانينO ( Safranin O ) وأيضا الهيماتوكسيلين  ( Haematoxylin

ب ) الصبغات الحمضية  Acid stains :

هي صبغات تحتو على جذور حمضية عضوية ملونه تتحد مع قاعدة معدنية غير ملونة للأنسجة وتكون عادة من الصوديوم أو البوتاسيوم وهي إما تذوب في الماء أو الكحولات أو كليهما ومن أمثلتها الصبغة الخضراء الباهتة S.F. المصفرة Yellowish . وصبغة الأيوسين Y ( Eosin  Y  ) .

ج ) الصبغات المتعادلة Neutral stains  :

صبغات مركبة من صبغات حمضية وقاعدية وتكون فيها الأيونات الموجبة والسالبة حاوية على مجاميع من حاملات اللون  Chromophores تذوب هذه الصبغات عادة في الكحولات وربما تذوب في الماء وكثيرا ما تكون محاليل غروية ومن أمثلتها الأحمر المتعادل  Neutral red

                        طرق تحضير بعض الصبغات واستعمالاتها

1 ـ صبغة بوراكس ـ كارمين  Carmine Borax  :

من الصبغات المفردة Single stains أو الصبغات المتعادلة Neutral stain التي تستخدم بصورة عامة لصبغ المقاطع وكذلك النماذج الكاملة الصغيرة الحيوانية أو النباتية مثل جنين الدجاج Chick embryo والعضلات Muscles ولطحالب Fucus .

4 جرام من مسحوق البوركس .

3 جرام من صبغة الكارمين .

100 سم/مكعب ماء مقطر ، يُسخن المزيج .

100 سم/مكعب كحول 70% ويُترك لمدة يومين ثم يرشح المحلول .

2 ـ هيما توكسلين ديلافيلد  Delafield`s Haematoxylin:

صبغة قاعـدية ، تستخدم في صبغ النوة و والكروماتين و ألياف المغزل والحيوانـات البدائية ( الأوليات ) والصفائح المنخلية النباتية والخصي والحبل الشوكي والغدد الدرقية .

طريقة تحضير الصبغة :

1 ـ 400سم / مكعب من محلول مشبع من شب الأمونيا .

2 ـ 25سم / مكعب مـن 16%  هيماتوكسلين في كحول مطلق ، حيـث يوضع في دورق مغلق

بالقطن ثم يعرض لأشعة الشمس لمدة 4 أيام ثم يرشح ، يؤخذ الراشح ويضاف له

أ ) 100سم/ مكعب من الجليسرين .

ب ) 100 سم/ مكعب كحول مطلق ( 100 % ) .

نضع المزيج في زجاجة شفافة حيث توضع في مكان دافئ ومضاء لمدة 6أسابيع لكي تنضج ولتعجيل نضوج الصبغة نضيف مركب فوق أكسيد الهيدروجين .ويمكن حفظ الصبغة لسنين عديدة في أوعية زجاجية محكمة الغلق ( ملحوظة : يجب ترشيح   الصبغة قبل كل إستعمال ) .

3 ـ هيماتوكسلين إرليك  Ehrlich’s  haematoxylin :

صبغة قاعدية وتستخدم بصورة عامة لجميع الأنسجة الحيوانية وخاصة عند إستخدام الأيوسين كصبغة مضادة حيث تصبغ الكلية والكبد والخصي

تحضير الصبغة :

1 ـ 2 جم من الهيماتوكسيلين .

2 ـ 100 سم / مكعب كحول مطلق ثم يضاف عليه :

أ ـ 100سم م مكعب جليسرين .

ب ـ 10سم / مكعب حامض الخليك الثلجي . ثم تضاف كمية من شب البوتاسيوم

تترك الصبغة في قارورة زجاجية معرضة لضوء الشمس ، وتفتح القنينة لفترة قصيرة ثم تغلق وترج .تعاد هذه العملية لعدة أسابيع إلى أن يتم نضج الصبغة ، ويمكن إنضاج الصبغة آنيـا بإضافة 24, 0 جـرام أيودات الصوديوم  Sodium Iodate .

4 ـ الأيوسـين Yالمصفـرة Eosin Y yellowish :

صبغة حامضية تستعمل بصورة عامة لصبغ السيتوبلازم الخاص بالخلايا الحيوانية ، وكذلك في الأنسجة النباتية .

طريقة التحضير :

واحد جرام من الصبغة تذاب في 99% كحول تركيز 75% أو 95% أو بإذابة : واحد جرام من الصبغة في 99سم/مكعب من الماء المقطر .

5 ـ السفرانين O ( Safranin  O  ) :

صبغة قاعدية مهمة جدا وخصوصا بالنسبة للأنسجة النباتية حيث تصبغ جميع الأجزاء الملجنة والمسوبرة ( بالسيوبرين ) والكروموزومات والنواة والأجسام المركزية  والفطريات والصفائح المنخلية والأوعية الخشبية وكذلك تصبغ الأنسجة الحيوانية حيث تصبغ الألياف المرنة والحيوانات وحيدة الخلية والخلايا القطنية .

طريقة تحضير الصبغة :

تحضر بإذابة واحد جرام من الصبغة في 100سم/ مكعب من الكحول المطلق ، ثم يخفف المحلول بالماء المقطر بنسبة 1 : 1 قبل إستعمالها للصبغ ، في عملية الصبغ يعتمد زمن الصبغ على طبيعة العينة بحيث يستغرق الزمن من 2 إلــى 24 ساعة .

6 ـ أزرق الميثلين Methylene blue  :

من الصبغات القاعدية والمستخدمة بصورة خاصة في صبغ البكتريا والخمائر كثيرا ما تستعمل للنماذج الحيوانية وقليلا للنماذج النباتية حيث تصبغ الدم والأنسجة الطلائية والأنسجة العصبية والإبتدائيات :

تحضير الصبغة في حالة إستخدامها كصبغة عادية :

1 ـ يذاب 1جم من مسحوق الصبغة في 100سم/مكعب كحول تركيزه 95% .

2 ـ يضـاف 100سم/مكعب ماء مقطر.

تحضير الصبغة في حالة إستخدامها كصبغة حيوية :

يذاب 1جم من مسحوق الصبغة مع 6, 0 جم كلوريد الصوديوم في 100سم/مكعب ماء مقطر ثم تترك العينة في الصبغة لمدة 10 ـ 15 دقيقة .

                            طرق التفكيك بالنقع Maceration

هي طريقة كيميائية لتفكيك عناصر النسيج الكثيف جدا والمتماسك المكونات والذي لا يمكن التعامل معه عندما يكون طريا . وبهذه الطريقة يمكن الحصول على عناصر كاملة للنسيج وبهذا يمكن تحديد شكل خلايا ذلك النسيج . ومن الأمثلة على ذلك تفكيك الألياف بشكل مفرد في حالة العضلة أو العصب أو الخشب النباتي .

تستعمل لهذا الغرض سوائل خاصة ليست بمثبتات ولهذا يجب أن نتبع بنوع أو آخر من أنواع المثبتات . هناك سوائل تفكك أخرى تفيد كمثبت ضعيف في نفس الوقت . كما قد تحتوي بعض المثبتات على عوامل مذيبة لبعض العناصر في ذلك النسيج فمثلا قد يحتوي مثبت معين على مذيب للنسيج الرابط و بذلك فهو يثبت ويفكك مكونات النسيج في نفس الوقت . لأن السوائل المدرجة أدناه هي من السوائل الشائعة للتفكيك بالنقــع :

1 ـ 30% كحول لمدة 24 ساعة أو أكثر .

2 ـ جزء واحد فورمالين في 100 جزء من محلول 10% كلوريد الصوديوم لمدة 24 ساعة أو أكثر .

3 ـ 1% كلوريد الصوديوم لمدة 24 ساعة أو أكثر .

4 ـ 2, 0% محلول مائي لحامض الكروميك لمدة 24ساعة .

5 ـ 20% حامض النتريك لمدة 24 ساعة . يوصى به للعضلات الملساء في المثانة .

6 ـ محلول مشبع لحامض البوريك في محلول ملحي Saline ( ماء البحر للنماذج البحرية ) مع إضافة قطرتين من محلول اليود ( محلول لوكول ) لكل 25سم/ مكعب مدة النقع من 2 ـ 3 أيام .

7 ـ 33% محلول لهيدروكسيد البوتاسيوم . هذا المحلول جيد لتفكك العضلة الملساء والمخططة والأنسجة النباتية . مدة النقع 1 ـ 1.5 ساعة ثم يفرق النسيج بواسطة الإبرة وتدعى العملية هذه بالتفريق   teasing

8 ـ النقع بالإنزيمات . إنه جيد لشبكة النسيج الرابط .

9 ـ0.01% حامض الأوزميك . أنه يفكك ويثبت الألياف العضلية في أيام قليلة . عند إضافة 1% من حامض الخليك إلى هذا المحلول يسبب تفككا أسرع . وتستعمل قطع صغيرة من النسيج عادة .

10 ـ محلول هارلو Harlow’s solution :

يستخدم محلول هارلو لتفكيك الخشب ويتكون هذا السائل من محلولين :

المحلول الأول :

محلول مشبع من الكلورين ( ماء الكلور ) .

المحلول الثاني :

يتكون من 3جم كبريتيت الصوديوم في 100سم / مكعب ماء .

توضع قطع صغيرة من الخشب في المحلول  الأول لمدة ساعتين ثم تنقل إلى المحلول الثاني المسخن إلي درجة 90ْ م لمدة 15 دقيقة . ثم ترجع القطع إلى المحلول الأول مرة أخرى وتترك لمدة ساعتين ثم إلى المحلول الثاني وهكذا تعاد العملية إلى أن يظهر الخشب بلون أحمر عند وضعه في المحلول الثاني . إن الرج البسيط سيفكك المادة إلى مكوناتها الليفية .

كما يمكن تحضير حجمان متساويان من 10% حامض النتريك و10% حامض الكروميك . حيث يستعمل هذا المحلول لتفكيك أنسجة الجسم.

                             ***** النهـــــــــاية ****

ليست هناك تعليقات:

إرسال تعليق