طـرق جمـع وحـفظ العينات النباتية بالتعشيب، التصبير بالضاغط الخشبي

تختلف طرق ووسائل حفظ العينات النباتية بإختلاف طبيعتها عشبية كانت أم خشبية وكذلك بإختلاف الغرض من إستخدام العينات ولايتسع المجال لذكر كل الوسائل والطرق ونكتفي هنا بذكر ما يمكن أن نعمله بسهولة ونجاح في المعمل .

أولا : تجهيز النماذج النباتية وتجفيفها بطريقة الكبس :

          تستخدم هذه الطريقة مع العينات النباتية العشبية  وذلك لدراسة الشكل الظاهري للنبات ومقارنته مع نباتات أخرى أو أجزاء من  النبات . و الهدف من هذه الطريقة هو امتصاص الماء من أنسجة العينة النباتية مع الإحتفاظ بشكلها سليم وواضح .

          في هذه الطريقة تستخدم مكابس مكونه من لوحين يضغطان آليا على مجموعة من الأوراق بينها عينات النبات وفي المكبس لخشبي تستعمل حبال قوية تلف حول اسطوانتين من الخشب مركبتين على اللوحة العليا وتداران واحدة عكس الأخرى للضغط على مجموعة النباتات بين اللوحتين ، أما في المكبس الحديدي فإن الضغط يتم بلف يد تتصل بمحور حلزوني يضغط على قرص من الحديد مركب على لوح الخشب العلوي للمكبس والذي يضغط بدوره على مجموعة النباتات بين اللوحتين العليا والسفلى .

أ ) محاليل حفظ العينات بالشكل واللون الطبيعي :

                   محلول حفظ لعينات الخضراء

                   يحضر هذا المحلول بالنسب الآتية :

                   0.02 جم كبريتات النحاس

                        ( تذاب الكمية في 35سم / مكعب من الماء المقطر وبعد تمام الإذابة يضاف ) :

                   5 سم/ مكعب من حامض خليك ثلجي .

                   5 سم/ مكعب من محلول ( 40% ) فورمالدهيد .

                   50 سم/ مكعب كحول إثيلي ( 96% )

          ( يترك المحلول مدة كافية ( ليلة ) فإذا حدث ترسيب يرشح  )      

                   محلول لحفظ الفواكه الملونة ( أصفر ـ أحمر ـ برتقالي )

                             يحضر هذا المحلول بالنسب الآتية :

                   50 جم  من كلوريد الزنك .

                             ( تذاب الكمية في لتر ماء مقطر بالغليان ثم يرشح ويبرد )

          يضاف  25 سم/ مكعب من فورمالدهيد ( 40% )

                   25 سم/ مكعب جلسرين .

          يترك المحلول وقتا كافيا فإذا حدث ترسيب يروق ويؤخذ الرائق للإستعمال .

          ب ) محلول لحفظ عينات السيقان والجذور لعمل القطاعات ( محلول مثبت )

                   50 سم/ مكعب كحول إثيلي (96% )

                    5 سم/ مكعب حامض خليك ثلجي

                   10 سم/ مكعب فورمالدهيد ( 40% )

                   35 سم/ مكعب ماء مقطر .

        ملحوظة : لابد من غسل العينات المراد حفظها بالماء الجاري غسلا جيدا لإزالة كـل ما على سطحها

                         من أتربة ثم تغمر في المحلول وتحفظ في أواني زجاجية محكمة القفل .

          تدريب :

                   حاول أن تحفظ بعض العينات في البداية بمساعدة مدرس المادة ثم بنفسك مثل :

                   1 ـ أطوار مختلفة من بادرات النبات .

                   2 ـ مجموعة الثمار الطرية .

 يمكن الإستعاضة عن هذا المكابس في المنزل باستخدام لوحين من الخشب يوضع بينهما مجموعة النباتات ويضغط عليها بأثقال من أي نوع .

          وتتم طريقة تجهيز العينات على ثلاث مراحل ( الكبس ـ التسميم ـ التحميل ) بالطريقة الآتية :

أ ) ـ جهز أفراخا من الورق السميك الذي يتشرب الماء بمقاسات مناسبة ( قد نلجأ إلى ورق الجرائد أو ما يشبه ذلك عند الضرورة ) .

    ـ جهز أفراخ من الورق المقوى الأبيض بمقاسات مناسبة كلوحات تحميل للعينات .

    ـ أغسل العينات النباتية بالماء لإزالة  ما قد يكون على سطحها من الأتربة واتركها لتجف في الهواء . ثم

       أفردها كل عينة على حدة على فرخ من ورق التجفيف .

   ـ رص العينات فوق بعضها بحيث تفصل بينها من أعلاها ومن أسفلها كمية معقولة من ورق التجفيف.

( يراعى أن تكون العينات المرصوصة متقاربة في محتواها المائي على قدر الإمكان )

   ـ ضع المجموعة بين لوحتي المكبس واضغط عليه بقوة مناسبة واتركها مـدة يوم أو يومـين على حسب

       مواصفات العينات من حيث المحتوى المائي .

   ـ بدل ورق التجفيف بآخر ( جاف ) على فترات مع ترك الورق المستعمل ليجف في مكن جيد التهوية

     (كلما كانت العينات النباتية عصيرية كلما احتاجت إلى تبديل أوراق التجفيف على فترات متقاربة عدة مرات )

ب ) ـ بعد التأكد من جفاف العينات تماما يستحسـن أن تحصن هذه العينات ضد فعـل الحشرات وذلك

          بتسميمها خاصة إذا أريد الإحتفاظ بها لمدة طويلة . ويتم ذلك بغمر العينات في محلـول كحـولي

          بنسبة ( 1 : 1000) من كلوريد الزئبقيك ثم إنتشالها وتركها تجف في الهواء .

          ملحوظة :  يجب أخذ الحذر الشديد أثناء القيام بهذه العملية حيث أن كلوريد الزئبقيك مادة سامة

                          ويجب إستخدام قفازات من الجلد وتتناول العينات دائما بملقط وليس بليد .

ج ) ـ تثبت العينات بعد ذلك على لوحات العرض بحيث تكون أجزاؤها واضحة .

     ـ تلصق على اللوحة بطاقة معلومات ـ يكتب عليها ( إسم العينة ـ مكان جمعها ـ تاريخ جمعها ـ

         نوع التربة ـ بيانات أخرى كالفصيلة إذا أردت ) .

    ـ يستحسن أن يغطى سطح اللوح بورق سلوفان شفاف حتى يحفظ العينة من التكسر في أثناء تداولها .

ثانيا ـ حفظ العينات في محاليل :

        تستعمل المحاليل في هذا الصدد لغرضين أساسيين أولهما هو حفظ العينات بشكل ولون طبيعي . وثانيهما هو تثبيت جميع التراكيب في العينة وذلك عندما يراد دراسة تركيبها الداخلي .

               

          

                   

طرق مشاهدة العوامل الوراثية

لكي نشاهد العوامل الوراثية في الخلية لابد من مشاهدة الخلية في وضع الإنقسام الغير مباشر ، عليه سوف نتعلم طريقة تحضير القمة النامية لجذر نبات لمشاهدة مراحل الإنقسام الغير مباشر الكروموسومات نظرا للنمو المستمر في جذر النبات وخاصة قمة الجذر .

          لنستخدم القمة النامية لجذر البصل لدراسة الإنقسام الميتوزي ( الخيطي أو الفتيلي ) وتتم العملية كالتالي :

1 ـ يقطع الجزء القمي لجذر البصل ويوضع في زجاجة ساعة ثم يضاف عليه مزيج من الكحول 70% وحامض الخليك بنسبة 3 : 1 ولمدة 10 ـ 15 دقيقة .

2 ـ ينقل هذا الجزء إلى زجاجة ساعة أخرى ويضاف عليه مزيج حامض الهيدروكلوريك  وكحول 70% بنسبة 1 : 4 ولمدة 5 ـ 10 دقائق .

3 ـ ينقل هذا الجزء بعد إنتهاء المدة الذكورة إلى زجاجة ساعة فيها مزيج من الكحول 70% وحامـض الخليك مرة أخرى لإزالة أثر حامض الهيدروكلوريك ثم يغسل بالماء .

4 ـ ينقل جزء الجذر بانتباه وبهدوء إلى شريحة زجاجية نظيفة بعد صنع فلـم رقيق عليها من زلال البيـض ( Albumen ) ثم يهرس الجزء القمي للجذر إما بالطريقة السابق ذكرها أو بواسطة نهاية مقبض الإبرة الحديدي المستعمل في المختبر بحيث تتفرق الخلايا .

5 ـ يوضع المثبت شادن Shaudin`s Fluid فوق الهريس قبل أن تجف تماما لمدة 10ـ 15 دقيقة ( يحضر هذا المثبت من محلول 66سم /مكعب من محلول كلوريد الزئبقيك المائي المشبع و33سم/مكعب من 95% كحول إثيلي و5ـ10سم/ مكعب من حامض الخليك الثلجي ) .

6 ـ تغسل الشريحة الزجاجية بالماء لمدة 3 دقائق .

7 ـ يغمر الهريس بصبغة هيماتوكسلين هارس لمدة دقيقتين ثم تغسل الشريحة بالماء المقطر ثم ب 30% ، 70% ، 90% كحول ثم بالكحول المطلق لمدة 3 دقائق في كل مرة .

8 ـ تغمر الشريحة بالزايلين مرتين لمدة دقيقة واحدة في كل مرة ثم تحمل الشريحة ببلسم كندا ثم يوضع الغطاء الزجاج .

طريقة تحضير صبغة هيماتوكسيلين هارس Harris haematoxylin

          هذه الصبغة نووية قوية تستعمل كثيرا لصبغ الكروماتين الجنسي Chromatin Sex وتستغرق فترة الصبغ  من  2 ـ 5 دقائق وتحضر بالطريقة التالية :

ـ 1 جم من مسحوق الصبغة .

ـ 10سم/مكعب كحول مطلق .

ـ 20 جم شب الأمونيا أو البوتاس .

ـ 200سم / مكعب ماء مقطر .

ـ  0.5 أوكسيد الزئبقيك .

          يذاب مسحوق الهيماتوكسيلين في الكحول ويضاف الشب المذاب مسبقا في الماء الحار ، يُغلى المزيجان ثم يضاف أوكسيد الزئبقيك حيث سيتحول لون المحلول إلى أرجواني غامق . يُبرد المحلول بسرعة تحت الماء العادي ثم يُرشح قبل الإستعمال ـ يوصى بإضافة حامض الخليك الثلجي إلى المحلول السابق بعد التبريد لتزيد من شدة الصبغ النووي .

طريقــة رسم العينات Drawing samples

ترسم العينات المجهرية بطرق مختلفة ، وهناك العديد منها نذكر أهمها :

1 ـ الرسم بإستخدام العدسة العينية ذات الشبكة :

          في هذه الطريقة نستخدم عدسة عينية Eye lens ذات شبكة مقسمة إلى مربعات Squared griel بحيث يمكن ضبط البعد البؤري بحيث تشاهد العينة وكأنها مقسمة في كل مربع جزء من العينة ، ثم نضع قطعة من الورق مقسمة إلى مربعات بجانب المجهر نحدد المربعات على الورقة وما يقابلها في المجهر ثم يرسم في كل مربع على الورقة مايقابله في المجهر وبذلك نحصل على رسم تخطيطي على الورقة ذات المربعات مطابق لما شوهد في المجهر .

2 ـ الرسم بإستخدام المرآة العارضة :

          في هذه الطريقة يمكن إستخدام المنشور العارض Projection  prism أو العارض الفوق رأسي  Over head Projection أو المرآة العارضة Projection  meror وذلك بإستخدام مصدر ضوئي قوي مع استخدام قوة التكبير المرتفعة وذلك لكي نتمكن من الحصول على صورة واضحة للعينة .

          نسلط الضوء القوي من الأسفل حيث يمر الضوء من العدسة الشيئية ثم العدسة  العينية والتي يثبت على طرفها ( حافتها ) المرآة العاكسة والتي يسقط عليها الضوء القادم من العدسة العينية وينعكس على المرآة ساقطا جوار المجهر مظهرا الصورة والتي يمكن رسمها على ورقة بيضاء .

3 ـ إستخدام المنشور العارض في الرسم :

          يثبت المنشور على أنبوبة لمجهر الوحيدة المائلة حيث تعرض الصورة القادمة من العينية على شاشة أو قطعة من الورق بجانب المجهر .

4 ـ إستخدام أنبوب الرسم :

          أنبوب الرسم هو أصلح جهاز يمكن إستخدامه للرسم من المجهر ، حيث يركب بين الأنبوب وحامل عدسات المجهر أو المجاهر المجسمة وبواسطة هذه الطريقة تظهر صورة السطح المرسوم والقلم من طبقتان فوق العينة بحيث يمكن رؤيتهما معا في مجال الرؤيا بالنظر في العدسة العينية .

4 ـ استعمال الكاميرا المنيرة : Camera Lucida

          الكاميرا المنيرة جهاز عيني بسيط يستفاد منه لعمل رسوم تخطيطية معتدلة الدقة ذات مقياس ونسب صحيحة للنماذج المراد فحصها تحت المجهر ، الكاميرا المنيرة لا تستخدم بتاتا للرسوم التفصيلية ، وتضاف التفاصيل لمثل هذه الرسوم بواسطة العين سواء تحت القوة الصغرى أو القوة الكبرى للمجهر .

          تتكون أبسط أشكال الكاميرا المنيرة من جزئين هما موشور عاكس صغير ومرآة مستوية ، يكون سطح الموشور مطلي بالفضة ماعدا منطقة صغيرة  في المركز. يثبت هذا الموشور فوق العدسة العينية على الموشور وعلى سطح المنضدة من جانب واحد من المجهر .

          لإستعمال الكاميرا المنيرة توضع ورقة الرسم على المنضدة تحت المرآة ، كذلك يجب أن تكون شدة إضاءة النموذج المراد رسمه وشدة إضاءة الورقة متوازنة تماما. بالإضافة إلى هذا يكون ميلان المرآة بزاوية مقدرة تقديرا صحيحا ودقيقا على الورق.عند ذلك يستطيع الفاحص عند وضع نهاية قلم الرصاص على الورق وهو ينظر بعينه خلال المجهر رؤية صورة النموذج الذي تحت عدسة المجهر .

          يمكن الآن تتبع حدود النموذج المراد رسمه على الورق بواسطة قلم الرصاص . تذكر أن كل ذلك يحتاج إلى ممارسة لكي تكون العملية متقنة أكثر .

          تذكر أن ارم جزء مهم من العمل في العلوم الحياتية حيث يمكن أن تكشف المواد الأساسية لموضوع ما في صفحات قليلة إذا كانت الرسوم الممثلة صحيحة ودقيقة . وتذكر أن المواد اللازمة للرسم هي كالتالــي :

1 ـ أقـلام الرصاص من نوع  4H ، HB ، 2B وحبر هندي مقاوم للماء .

2 ـ أقلام ملونة  ( أحمـر وأزرق و أصفر ) .

3 ـ مسطرة وممحاة ودفتر للرسم و مبراة .

ملاحظــات :

ـ القلم الرصاص من نوع 4H يكون من النوع الصلد ويستعمل لعمل الخطوط .

ـ أما القلم HB فهو متوسط وفائدته لوضع حدود الرسم والتظليل .

ـ القلم 2B يستعمل لتظليل الأسود ولايستعمل إلا بعد تثبيت الرسم لتجنب المسح المستمر للرسم .

  

طرق التفكيك بالنقع Maceration

هي طريقة كيميائية لتفكيك عناصر النسيج الكثيف جدا والمتماسك المكونات والذي لا يمكن التعامل معه عندما يكون طريا . وبهذه الطريقة يمكن الحصول على عناصر كاملة للنسيج وبهذا يمكن تحديد شكل خلايا ذلك النسيج . ومن الأمثلة على ذلك تفكيك الألياف بشكل مفرد في حالة العضلة أو العصب أو الخشب النباتي .

          تستعمل لهذا الغرض سوائل خاصة ليست بمثبتات ولهذا يجب أن نتبع بنوع أو آخر من أنواع المثبتات . هناك سوائل تفكك أخرى تفيد كمثبت ضعيف في نفس الوقت . كما قد تحتوي بعض المثبتات على عوامل مذيبة لبعض العناصر في ذلك النسيج فمثلا قد يحتوي مثبت معين على مذيب للنسيج الرابط و بذلك فهو يثبت ويفكك مكونات النسيج في نفس الوقت . لأن السوائل المدرجة أدناه هي من السوائل الشائعة للتفكيك بالنقــع :

1 ـ 30% كحول لمدة 24 ساعة أو أكثر .

2 ـ جزء واحد فورمالين في 100 جزء من محلول 10% كلوريد الصوديوم لمدة 24 ساعة أو أكثر .

3 ـ 1% كلوريد الصوديوم لمدة 24 ساعة أو أكثر .

4 ـ 2, 0% محلول مائي لحامض الكروميك لمدة 24ساعة .

5 ـ 20% حامض النتريك لمدة 24 ساعة . يوصى به للعضلات الملساء في المثانة .

6 ـ محلول مشبع لحامض البوريك في محلول ملحي Saline ( ماء البحر للنماذج البحرية ) مع إضافة قطرتين من محلول اليود ( محلول لوكول ) لكل 25سم/ مكعب مدة النقع من 2 ـ 3 أيام .

  

7 ـ 33% محلول لهيدروكسيد البوتاسيوم . هذا المحلول جيد لتفكك العضلة الملساء والمخططة والأنسجة النباتية . مدة النقع 1 ـ 1.5 ساعة ثم يفرق النسيج بواسطة الإبرة وتدعى العملية هذه بالتفريق   teasing

8 ـ النقع بالإنزيمات . إنه جيد لشبكة النسيج الرابط .

9 ـ0.01% حامض الأوزميك . أنه يفكك ويثبت الألياف العضلية في أيام قليلة . عند إضافة 1% من حامض الخليك إلى هذا المحلول يسبب تفككا أسرع . وتستعمل قطع صغيرة من النسيج عادة .

10 ـ محلول هارلو Harlow’s solution :

          يستخدم محلول هارلو لتفكيك الخشب ويتكون هذا السائل من محلولين :

المحلول الأول :

          محلول مشبع من الكلورين ( ماء الكلور ) .

المحلول الثاني :

          يتكون من 3جم كبريتيت الصوديوم في 100سم / مكعب ماء .

توضع قطع صغيرة من الخشب في المحلول  الأول لمدة ساعتين ثم تنقل إلى المحلول الثاني المسخن إلي درجة 90ْ م لمدة 15 دقيقة . ثم ترجع القطع إلى المحلول الأول مرة أخرى وتترك لمدة ساعتين ثم إلى المحلول الثاني وهكذا تعاد العملية إلى أن يظهر الخشب بلون أحمر عند وضعه في المحلول الثاني . إن الرج البسيط سيفكك المادة إلى مكوناتها الليفية .

كما يمكن تحضير حجمان متساويان من 10% حامض النتريك و10% حامض الكروميك . حيث يستعمل هذا المحلول لتفكيك أنسجة الجسم

طرق تحضير بعض الصبغات واستعمالاتها

1 ـ صبغة بوراكس ـ كارمين  Carmine – Borax  :

          من الصبغات المفردة Single stains أو الصبغات المتعادلة Neutral stain التي تستخدم بصورة عامة لصبغ المقاطع وكذلك النماذج الكاملة الصغيرة الحيوانية أو النباتية مثل جنين الدجاج Chick embryo والعضلات Muscles ولطحالب Fucus .      

          4 جرام من مسحوق البوركس .

          3 جرام من صبغة الكارمين .

          100 سم/مكعب ماء مقطر ، يُسخن المزيج .

          100 سم/مكعب كحول 70% ويُترك لمدة يومين ثم يرشح المحلول .

2 ـ هيما توكسلين ديلافيلد  Delafield`s Haematoxylin:

          صبغة قاعـدية ، تستخدم في صبغ النوة و والكروماتين و ألياف المغزل والحيوانـات البدائية ( الأوليات ) والصفائح المنخلية النباتية والخصي والحبل الشوكي والغدد الدرقية .

طريقة تحضير الصبغة :

1 ـ 400سم / مكعب من محلول مشبع من شب الأمونيا .

2 ـ 25سم / مكعب مـن 16%  هيماتوكسلين في كحول مطلق ، حيـث يوضع في دورق مغلق   

       بالقطن ثم يعرض لأشعة الشمس لمدة 4 أيام ثم يرشح ، يؤخذ الراشح ويضاف له :

              أ ) 100سم/ مكعب من الجليسرين .

           ب ) 100 سم/ مكعب كحول مطلق ( 100 % ) .

          نضع المزيج في زجاجة شفافة حيث توضع في مكان دافئ ومضاء لمدة 6أسابيع لكي تنضج ولتعجيل نضوج الصبغة نضيف مركب فوق أكسيد الهيدروجين .ويمكن حفظ الصبغة لسنين عديدة في أوعية زجاجية محكمة الغلق ( ملحوظة : يجب ترشيح   الصبغة قبل كل إستعمال ) .

3 ـ هيماتوكسلين إرليك  Ehrlich’s  haematoxylin :

          صبغة قاعدية وتستخدم بصورة عامة لجميع الأنسجة الحيوانية وخاصة عند إستخدام الأيوسين كصبغة مضادة حيث تصبغ الكلية والكبد والخصي .

تحضير الصبغة :

          1 ـ 2 جم من الهيماتوكسيلين .

          2 ـ 100 سم / مكعب كحول مطلق ثم يضاف عليه :

             أ ـ 100سم م مكعب جليسرين .

          ب ـ 10سم / مكعب حامض الخليك الثلجي . ثم تضاف كمية من شب البوتاسيوم .

          تترك الصبغة في قارورة زجاجية معرضة لضوء الشمس ، وتفتح القنينة لفترة قصيرة ثم تغلق وترج .تعاد هذه العملية لعدة أسابيع إلى أن يتم نضج الصبغة ، ويمكن إنضاج الصبغة آنيـا بإضافة 24, 0 جـرام أيودات الصوديوم  Sodium Iodate .

4 ـ الأيوسـين Yالمصفـرة Eosin Y yellowish :

          صبغة حامضية تستعمل بصورة عامة لصبغ السيتوبلازم الخاص بالخلايا الحيوانية ، وكذلك في الأنسجة النباتية .

طريقة التحضير :

          واحد جرام من الصبغة تذاب في 99% كحول تركيز 75% أو 95% أو بإذابة : واحد جرام من الصبغة في 99سم/مكعب من الماء المقطر .

5 ـ السفرانين O ( Safranin  O  ) :

          صبغة قاعدية مهمة جدا وخصوصا بالنسبة للأنسجة النباتية حيث تصبغ جميع الأجزاء الملجنة والمسوبرة ( بالسيوبرين ) والكروموزومات والنواة والأجسام المركزية  والفطريات والصفائح المنخلية والأوعية الخشبية وكذلك تصبغ الأنسجة الحيوانية حيث تصبغ الألياف المرنة والحيوانات وحيدة الخلية والخلايا القطنية .

طريقة تحضير الصبغة :

          تحضر بإذابة واحد جرام من الصبغة في 100سم/ مكعب من الكحول المطلق ، ثم يخفف المحلول بالماء المقطر بنسبة 1 : 1 قبل إستعمالها للصبغ ، في عملية الصبغ يعتمد زمن الصبغ على طبيعة العينة بحيث يستغرق الزمن من 2 إلــى 24 ساعة .

6 ـ أزرق الميثلين Methylene blue  :

          من الصبغات القاعدية والمستخدمة بصورة خاصة في صبغ البكتريا والخمائر كثيرا ما تستعمل للنماذج الحيوانية وقليلا للنماذج النباتية حيث تصبغ الدم والأنسجة الطلائية والأنسجة العصبية والإبتدائيات :

تحضير الصبغة في حالة إستخدامها كصبغة عادية :

          1 ـ يذاب 1جم من مسحوق الصبغة في 100سم/مكعب كحول تركيزه 95% .

          2 ـ يضـاف 100سم/مكعب ماء مقطر.

تحضير الصبغة في حالة إستخدامها كصبغة حيوية :

          يذاب 1جم من مسحوق الصبغة مع 6, 0 جم كلوريد الصوديوم في 100سم/مكعب ماء مقطر ثم تترك العينة في الصبغة لمدة 10 ـ 15 دقيقة .

الصبغــات وطرق الصبغ Stains and Staining

الغرض من الصبغ Purpose for staning:

إن الغرض من الصبغ هو جعل أجزاء الخلايا أو الأنسجة أكثر وضوحا ، وللصبغ نظريات عدة كانت محل جدل بين العلماء ، حيث كان التساؤل : هل هي ظاهرة فيزيائية بحته أم ظاهرة كيميائية بحته أو هي ظاهرة تعتمد على الظواهر الكيميائية الفيزيائية ؟.

عموما فإن طرق أو طبيعة الصبغ تتأثر بواحد أو بمجموعة من العوامل منها التالي :

1 ـ قوة الصبغة .

2 ـ سرعة تأين كل من الأنسجة البروتينية والصبغات .

3 ـ الأس الهيدروجيني ( pH ) لمحلول صبغة وكذلك للأنسجة البروتينية .

4 ـ نوع المثبت المستخدم .

5 ـ نوع محلول الصبغة كحوليا أم مائيا .

6 ـ تركيز الصبغة في محلول ضعيفا كان أم قويا .

تصنيف الصبغــات Classification of stains  :

الصبغات مواد عضوية ملونة تكون في الغالب أملاحا ، وتمتلك من الخواص بحيث تستطيع الأنسجة مسكها بثبات ولا يمكن إزالتها منها حتى عند إستخدام مذيبات نفس المادة العضوية . من المعلوم أن جميع الصبغات يجب أن تكون محتوية على مجموعتين أساسيتين هما :

1 ـ مجموعة ذرية مرتبطة باللون تدعى حاملات اللون   Chromophores .

2 ـ مجموعة لها القابلية على ربط المركبات الكيميائية للصباغات مع الأنسجة وتدعى ماسكات اللون

        Auxochromes  وتقسم الصبغات بطرق مختلفة تبعا للأسس المعتمدة في التقسيم .ونأتي إلى ذكر بعض النماذج من تقسيم  الصبغات وهي كالتالي :

          تقسم الصفات تبعا لتركيز الأس الهيدروجيني للصبغة وعلى هذا الأساس من التقسيم يمكن تميز ثلاثة أنواع منها وهي :

أ ) الصبغات القاعدية  Basic stains :

      هذه الصبغات إما أن  تذوب في الماء أو في الكحولات أو بكليهما ومن أمثلتها صبغة السفرانينO ( Safranin O ) وأيضا الهيماتوكسيلين  ( Haematoxylin  ) .

ب ) الصبغات الحمضية  Acid stains :

      هي صبغات تحتو على جذور حمضية عضوية ملونه تتحد مع قاعدة معدنية غير ملونة للأنسجة وتكون عادة من الصوديوم أو البوتاسيوم وهي إما تذوب في الماء أو الكحولات أو كليهما ومن أمثلتها الصبغة الخضراء الباهتة S.F. المصفرة Yellowish . وصبغة الأيوسين Y ( Eosin  Y  ) .

ج ) الصبغات المتعادلة Neutral stains  :

    صبغات مركبة من صبغات حمضية وقاعدية وتكون فيها الأيونات الموجبة والسالبة حاوية على مجاميع من حاملات اللون  Chromophores تذوب هذه الصبغات عادة في الكحولات وربما تذوب في الماء وكثيرا ما تكون محاليل غروية ومن أمثلتها الأحمر المتعادل  Neutral red .